克(ke)隆 (電(dian)擊(ji)) 感(gan)受態細胞(bao)的常規(gui)操(cao)作方法(fa)

操(cao)作說明(ming)：

壹、0.1cm電(dian)擊(ji)杯和杯蓋從(cong)儲(chu)存液(ye)中(zhong)拿出倒(dao)置於幹(gan)凈的(de)吸水(shui)紙上(shang)5分鐘(zhong)，待其瀝幹(gan)水(shui)分，正(zheng)置(zhi)5分鐘(zhong)，使乙(yi)醇充分(fen)揮(hui)發，待乙(yi)醇揮發(fa)幹(gan)凈立(li)即(ji)插入冰(bing)中，壓(ya)實冰(bing)面，電(dian)極(ji)杯頂(ding)離冰(bing)面 0.5cm以方便(bian)蓋(gai)上(shang)杯蓋，冰(bing)中靜(jing)置(zhi)5分鐘(zhong)充分(fen)降(jiang)溫。 

二、取(qu)-80℃保(bao)存的(de)TOP-10電(dian)擊(ji)感(gan)受態細胞(bao)插入冰(bing)中5分(fen)鐘(zhong)，待其融化(hua)，加(jia)入目的DNA (質粒或(huo)連接(jie)產物)並(bing)用(yong)手bo打(da)EP管底輕輕混(hun)勻，避免產生氣(qi)泡，立(li)即(ji)插入冰(bing)中。

A.測(ce)定轉(zhuan)化(hua)效(xiao)率(lv)使用1μl 10pg/μl的(de)對(dui)照質粒pUC19；  

B.對(dui)於連接(jie)產物，請(qing)用乙(yi)醇沈澱(dian)DNA後(hou)加入適量TE緩沖(chong)液(ye)(10mM TrisHCl，pH7.5；1mM EDTA)重懸，DNA濃(nong)度不(bu)超(chao)過100ng/μl，體(ti)積不(bu)超(chao)過5μl/50μl 感(gan)受態。 

三、用(yong)200μl槍(qiang)頭將(jiang)感(gan)受態-DNA混(hun)合物快(kuai)速移(yi)到(dao)電(dian)擊(ji)杯中，避免產生氣(qi)泡，蓋上(shang)杯蓋。 

四、啟(qi)動(dong)電(dian)轉(zhuan)儀，設(she)置參(can)數：C=25μF，PC=200Ω，V=1.8kV(此為BioRad電(dian)轉(zhuan)儀推(tui)薦(jian)參(can)數，也(ye)可(ke)按(an)所(suo)用電(dian)轉(zhuan)儀推(tui)薦(jian)的(de)參數操(cao)作），將(jiang)電(dian)擊(ji)杯快速放(fang)入電(dian)轉(zhuan)槽中(zhong)，電(dian)擊(ji)完成(cheng)快速(su)插入冰(bing)中。  

五、2分鐘(zhong)後(hou)從(cong)冰(bing)中取(qu)出(chu)電(dian)擊(ji)杯，放(fang)室溫，加(jia)入700μl不含抗生素的無菌S.O.C.培養基（室溫），用(yong)1ml槍(qiang)吹吸電(dian)擊(ji)杯底部(bu)數次混(hun)勻後(hou)，轉(zhuan)移(yi)到(dao)50ml離心管（BD Falcon50ml錐形(xing)離心管等），向離心管中補加S.O.C.培(pei)養基至5ml。37℃，225rpm 復蘇(su)60分鐘(zhong)。

六(liu)、5000rpm離心壹分鐘(zhong)收菌，重懸後(hou)取(qu)100-200μl塗布到含相(xiang)應抗生素的S.O.C平(ping)板(ban)上(shang)（因菌量較(jiao)大，若(ruo)全部(bu)塗板(ban)請(qing)選用(yong)直徑15cm培(pei)養皿(min)2-5個）。將(jiang)平(ping)板(ban)倒(dao)置放(fang)於37℃培養箱(xiang)過(guo)夜(ye)培(pei)養13-17小(xiao)時(shi)。